Pipettieren mit Kolbenhubpipetten

Anleitung zum richtigen Pipettieren mit Kolbenhubpipetten

Kolbenhubpipetten (Air-Displacement-Pipetten) ermöglichen das präzise Dosieren kleiner Flüssigkeitsvolumina. Die Genauigkeit beim Pipettieren wird massgeblich durch die Haltung, die Auswahl des geeigneten Geräts sowie die Anwendung der passenden Pipettiertechnik beeinflusst.

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Schritte zur korrekten Handhabung von Pipetten

1. Vorbereitung

• Pipette und passende Pipettenspitze für das gewünschte Volumen wählen.
• Pipette und Flüssigkeit akklimatisieren: Pipette, Spitzen und Flüssigkeit sollten auf die gleiche Temperatur gebracht werden, um Messfehler zu vermeiden.
• Pre-Wetting-Methode: Pipettenspitze mit der gewünschten Flüssigkeit benetzen.
• Volumen einstellen: das gewünschte Volumen an der Pipette einstellen.

2. Flüssigkeit aufziehen

• Pipette senkrecht halten: die Pipette senkrecht zur Flüssigkeit ausrichten (maximal 10° Abweichung).
• Kolben bis zum ersten Druckpunkt drücken (Vorwärtspipettieren).
• Eintauchtiefe beachten: die Pipettenspitze 2–3 mm tief in die Flüssigkeit eintauchen, bei grösseren Volumina bis zu 6 mm.
• Kolben langsam bewegen: den Kolben langsam und gleichmässig nach oben bewegen, um die Flüssigkeit aufzuziehen.
• Kurz warten: nach dem Aufziehen kurz warten, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit vollständig in die Spitze gelangt ist.

Wie stark Eintauchtiefe und Haltung das Ergebnis beeinflussen, zeigt der Vergleich:

• Richtig: Wird die Pipette senkrecht gehalten und die Spitze maximal 10 mm tief eingetaucht, beträgt die Ungenauigkeit nur etwa 0,2–0,4 %.
• Zu tief: Taucht die Spitze etwa 3 cm tief ein, verdoppelt sich die Ungenauigkeit (0,6–0,8 %).
• Zu tief und schräg: Wird die Pipette zusätzlich in einem Winkel von 30–40° gehalten, erhöht sich die Ungenauigkeit auf das Drei- bis Fünffache (1–1,2 %).

3. Flüssigkeit abgeben

• Pipettenspitze an der Innenwand des Zielgefässes im richtigen Winkel halten: die Pipette beim Abgeben der Flüssigkeit in einem Winkel von 45° halten.
• Kolben langsam bis zum ersten Druckpunkt drücken und kurz warten, dann wird der Kolben bis zum zweiten Druckpunkt gedrückt, um die Restmenge abzugeben.
• Spitze bei gedrücktem Kolben aus dem Gefäss ziehen und die gebrauchte Pipettenspitze mit dem Auswurfsystem entfernen und fachgerecht entsorgen.

Pre-Wetting

Das Pre-Wetting der Pipettenspitze ist eine einfache, aber effektive Methode, um die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit beim Pipettieren, insbesondere bei flüchtigen oder viskosen Flüssigkeiten, zu verbessern.

Durch das Vorbenetzen wird die Innenwand der Spitze gleichmässig befeuchtet, wodurch Verdunstungsverluste sowie Volumenschwankungen reduziert werden. Die Technik besteht darin, die Pipettenspitzen vor dem eigentlichen Pipettiervorgang mehrmals mit der zu pipettierenden Flüssigkeit zu befüllen und wieder zu entleeren. So wird die Spitze effektiv vorgefeuchtet.

Ablauf der Pre-Wetting-Technik

1. Kolben bis zum ersten Druckpunkt drücken.
2. Pipettenspitze senkrecht (90°) in die Flüssigkeit tauchen (Achtung: NUR die Spitze).
3. Kolben langsam loslassen, dabei wird das gewünschte Volumen angesaugt.
4. Flüssigkeit abgeben: Kolben bis zum ersten Druckpunkt drücken, dabei wird die Flüssigkeit vollständig wieder in das Ursprungsgefäss zurückgegeben.
5. Schritte 3 und 4 mehrmals wiederholen (2–3 Mal), dabei wird die Innenwand der Spitze mit der Flüssigkeit benetzt.
6. Nun kann die Flüssigkeit wie gewohnt aufgezogen und abgegeben werden.

Wird unterhalb von 35 % des Maximalvolumens pipettiert, nimmt der Anteil an «toter Luft» im System deutlich zu. Dadurch steigt das Risiko für ungenaues und unpräzises Pipettieren.

Vorwärtspipettieren (Forward Pipetting)

Diese Technik wird empfohlen für das Pipettieren wässriger, nicht-viskoser Flüssigkeiten.

Beim Vorwärtspipettieren wird das gewünschte Flüssigkeitsvolumen in die Pipettenspitze aufgenommen, indem der Kolben bis zum ersten Druckpunkt gedrückt und langsam wieder in die Ausgangsposition bewegt wird. Um die Probe abzugeben, wird der Kolben nun bis zum zweiten Druckpunkt gedrückt. Am Ende des Pipettiervorgangs wird ein zusätzlicher Ausstossschritt (Blow-out) ausgeführt.

Rückwärtspipettieren (Reverse Pipetting)

Diese Technik wird empfohlen für das Pipettieren von viskosen, schäumenden oder flüchtigen Flüssigkeiten, wie z. B. Glycerol, Serum, Tween 20 oder Ethanol. Sie verhindert die Bildung von Tropfen und Luftblasen und ermöglicht eine höhere Übertragungseffizienz bei Proben, die leicht aufschäumen.

Beim Rückwärtspipettieren wird eine überschüssige Menge Flüssigkeit in die Pipettenspitze aufgenommen, indem der Kolben bis zum zweiten Druckpunkt gedrückt wird. Um die Probe abzugeben, wird der Kolben nur bis zum ersten Druckpunkt gedrückt – der überschüssige Teil verbleibt in der Pipettenspitze. Diese Restmenge kann anschliessend verworfen oder in das Ursprungsgefäss zurückgegeben werden.

Zusammenfassung: Vorwärts- und Rückwärtspipettieren mit Kolbenhubpipetten

Tabelle 2: Vorwärts- und Rückwärtspipettieren im Vergleich