Anwendungen und Konzentrationsbestimmung

Anwendungen der Spektrophotometrie

• Quantitative Analyse von Lösungen: Bestimmung der Konzentration von Ionen, Molekülen oder Farbstoffen. Beispiel: Messung der Vitamin-B2-Konzentration in Lebensmitteln.
• Überwachung chemischer Reaktionen: Verfolgung des Reaktionsfortschritts durch Messung der Absorption bei charakteristischer Wellenlänge. Beispiel: Enzymatische Reaktionen oder Kinetikstudien.
• Identifikation von Substanzen: Bestimmung charakteristischer Absorptionsspektren zur Identifikation von Molekülen oder funktionellen Gruppen. Beispiel: UV-Vis-Spektroskopie von DNA bzw. Proteinen.
• Reinigungs- und Qualitätskontrolle: Kontrolle der Reinheit von Chemikalien oder pharmazeutischen Präparaten. Beispiel: Analyse von Verunreinigungen in Trinkwasser oder Medikamenten.
• Studium von Molekülinteraktionen: Untersuchung von Bindungen oder Komplexbildungen. Beispiel: Protein-Ligand-Interaktionen über Änderungen im Absorptionsspektrum.
• Umweltanalytik: Messung von Schadstoffen wie Nitrat, Nitrit oder Schwermetallen in Wasserproben.

Bedienungsanleitung für das UV/Vis-Spektrophotometer

Vorbereitung

1. Gerät einschalten Spektrophotometer einschalten und einige Minuten vorwärmen lassen, falls vom Hersteller empfohlen.
2. Wellenlänge einstellen Die gewünschte Messwellenlänge einstellen (z. B. 280 nm für Proteine oder 595 nm beim Bradford-Assay).
3. Küvetten vorbereiten
   • Saubere, klare Glas- oder Kunststoffküvetten sollen verwendet werden.
   • Die Aussenseite der Küvette muss mit einem fusselfreien Tuch sauber abgewischt werden (z. B. Kimwipes).
   • Küvetten nur an den matten Seiten anfassen – nie an den klaren Messflächen.

Blank-Messung (Nullabgleich)

4. Blanklösung einfüllen Befüllen der Küvette mit der Leer- oder Referenzlösung (z. B. Wasser, Reagenz ohne Analyt oder Pufferlösung). Luftblasen in der Küvette sollen vermieden werden – sie können die Messung stark verfälschen.
5. Küvette einsetzen Die Küvette wird in das Spektrophotometer eingesetzt; dabei ist darauf zu achten, dass die 1-cm-Schichtdicke entlang des Lichtstrahls ausgerichtet ist.
6. Null setzen Durch Drücken der Taste für «Zero», «Blank» oder «Tara» wird die Absorption auf 0,000 gesetzt. Diese Referenz wird für alle weiteren Proben verwendet.

Probenmessung

7. Probe einfüllen Befüllung der Küvette mit der Probe (z. B. Reagenz plus Proteinlösung) unter Beachtung, dass keine Luftblasen entstehen, da diese die Absorptionsmessung stark verfälschen können.
8. Küvette einsetzen und messen Setzen Sie die Küvette wie zuvor in das Gerät ein und notieren Sie die Absorption.

9. Wiederholung des Messvorgangs Die Schritte 7–8 werden für alle weiteren Proben oder Standardlösungen wiederholt.

Datenauswertung

10. Daten auswerten
    • Die Absorptionswerte $(y)$ und Konzentrationen $(x)$ werden in einem Diagramm aufgetragen (bei Standardkurve).
    • Die Konzentrationen unbekannter Proben werden entweder über die Standardkurve oder mit dem Lambert-Beer’schen Gesetz berechnet.

Nachbereitung

11. Küvetten reinigen Die Quarz-Küvetten werden gründlich mit destilliertem Wasser und Ethanol gereinigt und an der Luft trocknen gelassen oder mit Druckluft getrocknet. Einwegküvetten sollten nach dem Entleeren fachgerecht entsorgt werden.
12. Gerät ausschalten Das Spektrophotometer wird ausgeschaltet und ggf. abgedeckt.

Quantitative und qualitative Analyse

Drei wesentliche Methoden spielen dabei eine zentrale Rolle:

1. Spektrum Das Absorptionsspektrum ist das «fingerprintartige» Diagramm der Lichtaufnahme einer Substanz über verschiedene Wellenlängen.
   • Jedes Molekül absorbiert Licht charakteristischer Wellenlängen im UV- oder sichtbaren Bereich.
   • Durch Aufnahme eines Absorptionsspektrums kann die Wellenlänge identifiziert werden, bei der die Substanz am stärksten absorbiert (Maximum der Absorption, $\lambda_{max}$).
2. Lambert-Beer’sches Gesetz
   • Beschreibt den Zusammenhang zwischen der Absorption und der Konzentration.
   • Das Gesetz gilt im linearen Bereich, in dem die Absorption direkt proportional zur Konzentration ist.
3. Standardkurve Eine Standardkurve ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der bekannten Konzentration einer Substanz und einem messbaren Signal (z. B. Absorption) darstellt. Sie dient dazu, die Konzentration unbekannter Proben zu bestimmen.
   • Zur praktischen Bestimmung unbekannter Konzentrationen werden Lösungen bekannter Konzentration gemessen.
   • Die gemessenen Absorptionen werden gegen die Konzentration aufgetragen, wodurch eine Standardkurve entsteht.
   • Die Konzentration unbekannter Proben kann dann anhand dieser Kalibrierkurve bestimmt werden.

Absorptionsspektrum von Makromolekülen

Da DNA und Proteine Absorptionsmaxima bei verschiedenen Wellenlängen aufweisen, können sie photometrisch unterschieden werden. Dazu eignet sich ein Spektrum von 210 bis 350 nm (Quarzküvetten) bzw. von 230 bis 350 nm bei der Verwendung von UV-Plastikküvetten. DNA weist ein Absorptionsmaximum bei 260 nm und Proteine bei 280 nm auf. Oberhalb von 325 nm absorbieren weder DNA noch Proteine. Bei dieser Wellenlänge gemessene Absorptionen sind auf Verunreinigungen, auf Lichtstreuung oder in seltenen Fällen auf farbige Proteine (z. B. Hämoglobin) zurückzuführen.

Nukleinsäurelösung

Eine Nukleinsäurelösung zeigt ein typisches UV-Absorptionsspektrum mit einem Maximum bei 260 nm. Die aromatischen Basen der Nukleinsäuren sind für die Absorption bei dieser Wellenlänge verantwortlich. Messungen im UV-Bereich können jedoch durch weitere Substanzen in der Probe verfälscht werden. Die Reinheit einer Nukleinsäureprobe kann durch die zusätzliche Messung der Absorption bei 230 nm (Detektion organischer Substanzen) und 280 nm (Detektion von Proteinen und Phenolen) ermittelt werden. Für eine reine DNA-Probe sollten die Absorptionsverhältnisse bei den Wellenlängen von 260 zu 280 nm bzw. 260 zu 230 nm folgende Werte erreichen:

Bestimmung der DNA-Konzentration durch Absorptionsmessung

Die Konzentration von Nukleinsäuren (DNA oder RNA) in einer Lösung kann photometrisch bestimmt werden. Die Messung wird in einer Quarzküvette oder in einer UV-Mikrotiterplatte bei einer Wellenlänge von 260 nm durchgeführt. Aus der Absorption der Lösung kann die Konzentration anhand des folgenden Verhältnisses berechnet werden:

Tabelle 2: Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren aus der Absorption bei 260 nm

Proteine

Bestimmung der Protein-Konzentration durch Absorptionsmessung

Eine Proteinlösung zeigt ein charakteristisches UV-Absorptionsspektrum mit einem Absorptionsmaximum bei 280 nm. Diese Absorption wird hauptsächlich durch die aromatischen Aminosäuren Tyrosin (Tyr, Y), Tryptophan (Trp, W) und Phenylalanin (Phe, F) sowie durch Disulfidbrücken zwischen Cysteinresten verursacht. Messungen im UV-Bereich können jedoch durch andere in der Probe enthaltene Substanzen beeinflusst werden. Um die Reinheit einer Proteinprobe zu überprüfen, wird zusätzlich die Absorption bei 260 nm, einem typischen Signalbereich für Nukleinsäuren, gemessen.

Ein Absorptionsverhältnis (A260/A280) von etwa 0,57 weist auf eine reine Proteinlösung hin, da ein höherer Wert auf Verunreinigungen durch Nukleinsäuren schliessen lässt. Abhängig von der Reinheit der Probe können die Messdaten auf zwei Arten ausgewertet werden:

• Bei reinen Proteinlösungen erfolgt die Konzentrationsbestimmung nach dem Lambert-Beer’schen Gesetz.
• Ist die Proteinprobe mit DNA kontaminiert, empfiehlt sich die Auswertung nach der Methode von Layne, die eine Korrektur für die Nukleinsäureanteile beinhaltet.

Methode nach Lambert-Beer

Die Messung der UV-Absorption bei 280 nm wird für die Konzentrationsbestimmung von reinen Proteinen empfohlen. Hierzu wird der molare Extinktionskoeffizient des Proteins benötigt,

der sich in erster Näherung über die Anzahl der Tyrosine und Tryptophane des Proteins bestimmen lässt.

Bei Oligonukleotiden mit bekannter Sequenz wird die Konzentration über das Lambert-Beer’sche Gesetz mit Hilfe der molaren Extinktionskoeffizienten der einzelnen Nukleotide berechnet.

Der molare Absorptionskoeffizient eines Proteins bei 280 nm kann mit ausreichender Genauigkeit aus dem Gehalt an Tyrosin, Tryptophan sowie dem Anteil an Disulfidbrücken und ihren jeweiligen Absorptionskoeffizienten berechnet werden:

Bei einem Proteingemisch wird die Gesamtproteinkonzentration in einer Annäherung wie folgt berechnet:

Methode nach Layne

Häufig enthalten Proteingemische noch geringe Mengen von Nukleinsäuren und Nukleotiden, die aber das UV-Licht wesentlich stärker absorbieren (0,05 mg/mL DNA bewirken eine UV-Absorption von 1 bei 260 nm und 0,5 bei 280 nm). Bei einer Verunreinigung einer Proteinprobe (wenn also $A_{260}/A_{280} > 0{,}57$) werden die folgenden Näherungsgleichungen verwendet, um die Proteinkonzentration zu bestimmen:

Bei dieser Näherung wird versucht, den Beitrag von Nukleinsäuren zur Absorption bei 280 nm durch die Bestimmung der Absorption bei 260 und 280 nm zu berechnen und in Abzug zu bringen.

Kolorimetrische Methode

Die kolorimetrische Methode ist ein analytisches Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Stoffes in Lösung anhand seiner Lichtabsorption. Dabei wird entweder die spezifische Absorption der Substanz selbst genutzt oder ein Reagenz eingesetzt, das mit dem Analyten reagiert und eine farbige Verbindung bildet. Die Intensität der entstandenen Farbe (gemessen als Absorption bei einer definierten Wellenlänge) ist direkt proportional zur Konzentration des gesuchten Stoffes.

Die Auswertung der kolorimetrischen Methode kann auf zwei Arten erfolgen:

1. Lambert-Beer’sches Gesetz: Wenn der molare Absorptionskoeffizient ε bekannt ist, kann die Konzentration des Analyten direkt aus der gemessenen Absorption berechnet werden:

   $$A = \varepsilon \cdot c \cdot d$$

   Diese Methode eignet sich besonders für reine Substanzen mit definierter chemischer Struktur und bekanntem Extinktionskoeffizienten, z. B. bei reinen Proteinlösungen, Vitaminlösungen etc.

2. Standardkurve (Kalibrierkurve): Ist der Extinktionskoeffizient nicht bekannt – etwa bei komplexen Mischungen oder bei Einsatz eines Farbreagenzes (z. B. Bradford, BCA) – wird die Konzentration mithilfe einer Standardkurve ermittelt. Diese basiert auf der Messung von Proben mit bekannten Konzentrationen und der Auftragung von Absorption gegen Konzentration.

   Diese Methode ist besonders geeignet für biologische Proben mit unbekanntem oder variierendem Absorptionsverhalten.

In der Praxis wird häufig die Standardkurvenmethode bevorzugt, da sie robust gegenüber Matrixeffekten und Schwankungen im Farbreagenz ist.

Standardkurve

Eine Standardkurve (auch Kalibrierkurve genannt) ist eine grafische Darstellung, die den Zusammenhang zwischen der Absorption (y-Achse) und der Konzentration einer Substanz (x-Achse) beschreibt. Sie wird erstellt, indem mehrere Standardlösungen mit bekannten Konzentrationen gemessen und ihre Absorptionswerte aufgezeichnet werden. Durch Auftragung dieser Werte entsteht in der Regel eine lineare Kurve, die anschliessend als Referenz zur Bestimmung der Konzentration unbekannter Proben dient.

Der Einsatz einer Standardkurve ist besonders dann sinnvoll, wenn:

• der Extinktionskoeffizient (ε) der Substanz nicht bekannt oder nicht konstant ist (z. B. bei Proteingemischen oder biologischen Proben),
• ein Farbreagenz verwendet wird (z. B. bei Bradford-, BCA- oder Lowry-Assays),
• eine hohe Genauigkeit bei der Konzentrationsbestimmung erforderlich ist.

Vorgehen:

1. Vorbereitung einer Reihe von Standardlösungen mit definierter Konzentration (Verdünnungsreihe).
2. Messung der Absorption jeder Lösung bei der relevanten Wellenlänge.
3. Auftragung der Absorption ($y$) gegen die Konzentration ($x$) in einem Diagramm.
4. Lineare Regression zur Bestimmung der Geradengleichung: $$y = m \cdot x + b$$
5. Berechnung der unbekannten Konzentration $x$ in einer Probe anhand der gemessenen Absorption $y$ und der Kalibriergeraden: $$x = \frac{y - b}{m}$$

Quiz: Spektrophotometrie

Spektrophotometrie: Fachrechnen-Aufgaben

Diese Aufgaben sind freiwillige Zusatzübungen: Sie zählen nicht zum Lektionsfortschritt, und die nächste Aufgabe erscheint jeweils nach dem Lösen der vorherigen.