Küvetten und Schichtdicke

Eine Küvette ist ein Gefäss mit parallelen Seitenflächen, das für optische Untersuchungen (UV/VIS-Spektroskopie) verwendet wird. In der Regel ist der Innenabstand zwischen den parallelen Seiten auf 1 cm genormt.

Die Intensität des Lichts nimmt mit der Schichtdicke der Probe exponentiell ab (Abbildung 6).

Küvette mit Lichtstrahl: Die Lichtintensität nimmt mit der durchquerten Schichtdicke exponentiell ab
Abbildung 6: Die Absorption A oder optische Dichte hängt von der Wellenlänge λ und der Schichtdicke d der Lösung ab. Die Intensität des Lichts nimmt mit der Schichtdicke der Probe exponentiell ab.

Die Gefässe sind aus Glas oder Kunststoff gemacht. Die Küvettenauswahl hängt vom Verwendungszweck ab (Abbildung 7).

Transmissionsspektren verschiedener Küvettenmaterialien im IR-, sichtbaren und UV-Bereich
Abbildung 7: Spektrum von verschiedenen Küvettenmaterialien im IR-, sichtbaren und UV-Bereich. Im Vergleich zum Quarzglas haben die Kunststoffküvetten (UV-durchlässiger Kunststoff bzw. PMMA) eine höhere Absorption im UV-Bereich und sind daher in diesem UV-Bereich nur eingeschränkt nutzbar.

Im UV-Bereich unterhalb von 200 nm müssen Quarzküvetten verwendet werden, da Kunststoffe (PMMA bzw. UV-durchlässige Kunststoffe) für Licht dieser Wellenlänge nicht transparent sind (Abbildung 8).

Spektren von Küvettenmaterialien im UV-Bereich: Quarzglas bleibt durchlässig, Kunststoffe absorbieren stark
Abbildung 8: Spektrum von verschiedenen Küvettenmaterialien im UV-Bereich. Im Vergleich zum Quarzglas haben die Kunststoffküvetten (UV-Kunststoff bzw. PMMA) eine höhere Absorption im UV-Bereich und sind daher in diesem UV-Bereich nur eingeschränkt nutzbar.
Verschiedene UV/VIS-Kunststoffküvetten
Abbildung 9: Verschiedene UV/VIS-Kunststoffküvetten.

Schichtdicke (Pathlength)

Die Schichtdicke dd bezeichnet in der Spektrophotometrie die Strecke, die das Licht beim Durchtritt durch die Lösung im Messgefäss zurücklegt. Sie ist ein entscheidender Parameter, da die Absorption AA direkt proportional zur Schichtdicke ist (Lambert-Beer’sches Gesetz) (Abbildung 10).

Vergleich der variablen Schichtdicke in einem Well einer Mikrotiterplatte mit der Standardschichtdicke einer Küvette
Abbildung 10: Variable Schichtdicke eines Wells vs. Standardschichtdicke einer Küvette.
  • dd wird meist in Zentimetern (cm)(\mathrm{cm}) angegeben.
  • In Küvetten entspricht die Schichtdicke in der Regel der Küvettenbreite, z. B. 1 cm1\,\mathrm{cm}.
  • In Mikrotiterplatten verläuft der Lichtweg vertikal durch die Flüssigkeitssäule; die effektive Schichtdicke hängt von der Füllhöhe der Probe, der Geometrie des Wells und dem Meniskus-Effekt ab (Abbildung 11).
Wells mit unterschiedlichen Meniskusformen und daraus resultierenden unterschiedlichen Schichtdicken bei gleichem Volumen
Abbildung 11: Verschiedene Lösungen können unterschiedliche Meniskusformen haben und daher unterschiedliche Schichtdicken bei gleichem Volumen.

Berechnung der Schichtdicke in einem Well einer Mikrotiterplatte (pathlength correction)

Die effektive Schichtdicke (dWell)(d_{\text{Well}}) in einem Well einer Mikrotiterplatte ist meist kleiner als in einer Standardküvette (dKu¨vette=1 cm)(d_{\text{Küvette}} = 1\,\mathrm{cm}) und muss für korrekte Absorptionsmessungen berücksichtigt werden.

Die Schichtdicke einer Lösung in einem Well lässt sich experimentell über die Absorption von Wasser im nahen Infrarotbereich (NIR) bestimmen. Wasser ist im Bereich von etwa 200 nm bis 900 nm weitgehend transparent, zeigt jedoch im NIR-Bereich bei ca. 977 nm eine markante Absorptionsspitze.

Hintergrund:Beispiel: Absorption von Wasser

Bestimmung der Absorption AH2OA_{\text{H2O}} in einer Küvette:

Die Absorption von Wasser bei einer definierten Wellenlänge (z. B. 977 nm) in einer Küvette mit Schichtdicke d=1 cmd = 1\,\mathrm{cm} wird berechnet nach:

AH2O=−log⁡10(II0)A_{\text{H2O}} = -\log_{10}\left(\frac{I}{I_0}\right)
  • I0I_0 = Intensität des einfallenden Lichts
  • II = Intensität des durch die Wasserprobe transmittierten Lichts

Die Absorption von Wasser (d=1 cmd = 1\,\mathrm{cm}) beträgt:

AH2O≈0,18A_{\text{H2O}} \approx 0{,}18

Üblicherweise wird die Absorption bei 977 nm und bei 900 nm gemessen (die Messung bei 900 nm dient dazu, die Absorption der Mikrotiterplatte und der Probe zu korrigieren).

Für Wasser mit einer Schichtdicke von d=1 cmd = 1\,\mathrm{cm} ergeben sich folgende Werte:

A977 nm/d=0,23 cm−1A_{977\,\text{nm}} / d = 0{,}23\,\mathrm{cm^{-1}}A900 nm/d=0,04 cm−1A_{900\,\text{nm}} / d = 0{,}04\,\mathrm{cm^{-1}}ΔA977−900 nm/d=0,18 cm−1\Delta A_{977-900\,\text{nm}} / d = 0{,}18\,\mathrm{cm^{-1}}

Die Differenz ΔA977−900 nm\Delta A_{977-900\,\text{nm}} wird verwendet, um die effektive Schichtdicke in Mikrotiterplatten zu bestimmen und die Pathlength-Korrektur durchzuführen.

In diesem Wellenlängenbereich haben die meisten biologischen Moleküle geringe oder keine Absorption. Daher kann die gemessene Absorption des Wassers im NIR-Bereich direkt auf die effektive Schichtdicke der wässrigen Probe zurückgerechnet werden.

Auf diese Weise lassen sich Absorptionsmessungen in Mikrotiterplatten vergleichbar zu Standardküvetten durchführen, obwohl die geometrische Höhe der Flüssigkeitssäule und der Meniskus-Effekt die effektive Schichtdicke beeinflussen.

  1. Prinzip

    Die Absorption AA ist proportional zur Schichtdicke dd:

    A=ε⋅c⋅dA = \varepsilon \cdot c \cdot d

    In einer Mikrotiterplatte ist dd kleiner als die Standardküvettenbreite (d=1 cmd = 1\,\mathrm{cm}).

  2. Messung der Wasser-Referenz

    • Wasser hat, gemessen bei 977 nm und korrigiert um die Messung bei 900 nm, in einer 1-cm-Küvette eine bekannte Absorption AH2O≈0,18A_{\text{H2O}} \approx 0{,}18.
    • Die Absorption desselben Volumens in der Mikrotiterplatte AWellA_{\text{Well}} wird gemessen.

  3. Berechnung der effektiven Schichtdicke

    Die effektive Schichtdicke dWelld_{\text{Well}} wird proportional berechnet:

    dWell=AWellAKu¨vette⋅dKu¨vetted_{\text{Well}} = \frac{A_{\text{Well}}}{A_{\text{Küvette}}} \cdot d_{\text{Küvette}}

  4. Korrektur der Messwerte

    Alle Absorptionswerte der Probe werden auf die Standard-Schichtdicke von 1 cm korrigiert:

    Akor=AProbedWell⋅1 cmA_{\text{kor}} = \frac{A_{\text{Probe}}}{d_{\text{Well}}} \cdot 1\,\mathrm{cm}
Hintergrund:Beispiel
  • Absorption von Wasser in 1-cm-Küvette: AH2O, Ku¨vette=0,18A_{\text{H2O, Küvette}} = 0{,}18
  • Absorption von Wasser im Well der Mikrotiterplatte: AH2O, Well=0,054A_{\text{H2O, Well}} = 0{,}054
  • Gemessene Absorption der Probe im Well: AProbe=0,32A_{\text{Probe}} = 0{,}32

1. Berechnung der effektiven Schichtdicke

dWell=AH2O, WellAH2O, Ku¨vette⋅dKu¨vetted_{\text{Well}} = \frac{A_{\text{H2O, Well}}}{A_{\text{H2O, Küvette}}} \cdot d_{\text{Küvette}}dWell=0,0540,18⋅1 cm=0,30 cmd_{\text{Well}} = \frac{0{,}054}{0{,}18} \cdot 1\,\mathrm{cm} = 0{,}30\,\mathrm{cm}

2. Korrektur der Probenextinktion

Akor=AProbedWell⋅1 cmA_{\text{kor}} = \frac{A_{\text{Probe}}}{d_{\text{Well}}} \cdot 1\,\mathrm{cm}Akor=0,320,30⋅1 cm≈1,067A_{\text{kor}} = \frac{0{,}32}{0{,}30} \cdot 1\,\mathrm{cm} \approx 1{,}067

Die korrigierte Absorption für die Probe bei einer Schichtdicke von 1 cm beträgt etwa 1,067. Diese Absorption kann nun direkt für die Konzentrationsbestimmung mit dem Lambert-Beer’schen Gesetz verwendet werden.